酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种广泛应用的免疫检测技术。该方法通过将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯等固相载体上，利用抗原与抗体的特异性结合来进行免疫反应的定性和定量检测。

ELISA的主要目的在于检测血清、尿液和细胞上清等生物液体中的特定抗原，以实现定性判断。其基本原理是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面，从而在固相表面进行酶标记的抗原抗体反应。

在实验过程中，首先设定标准孔、空白孔和样本孔。标准孔中加入100μL倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL的标准品和样本稀释液，其余孔加入待测样本（建议设立复孔并通过预实验或技术支持确定稀释倍数）。然后，给酶标板覆膜并在37℃孵育90分钟。在加样时，建议将样品加入酶标板底部，避免触及孔壁，并轻轻混合以防气泡产生，整个加样过程应控制在10分钟内。

完成加样后，甩干孔内液体而无需洗涤。随后每个孔中加入100μL生物素化抗体工作液，并再次覆膜，37℃温育1小时。此后，甩干孔内液体，用吸水纸拍干，并加入350μL洗涤液，每孔浸泡1分钟，随后吸去液体并拍干。该步骤需重复3次，可使用洗板机以提高效率。

洗板完成后，立即进行下一步操作，每孔加入100μL HRP酶结合物工作液。再次覆膜，37℃孵育30分钟，甩干液体并洗板5次，步骤与之前相同。接着，每孔加入90μL底物溶液（TMB），覆盖，避光孵育15分钟左右。根据显色情况可适当调整时间，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显的梯度时（前4个显色孔清晰显示蓝色），可停止孵育。提前15分钟开启酶标仪进行预热。

最后，每孔加入50μL终止液以中止反应，并及时用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。不同实验条件可能导致标准曲线的OD值有所不同，因此实验室建立的标准曲线仅供参考。以下是本实验室的标准曲线：（NE浓度与OD值参考数据）

对于血清、血浆或其他液体样本，建议使用100μL进行检测。未经处理的全血样本，可分离出100-200μL的血清，因此实际样本量需根据送检情况而定，建议全血样本在4℃保存，其余液体样本在-20℃冷冻保存。当涉及组织样本时，需至少准备0.1g（约黄豆大小），以便最终获得约500μL的匀浆上清液，从而能够检测5个指标，样本需在-20℃下冷冻保存后送检。

选择EVO视讯品牌的酶联免疫吸附测定方案，确保您获得高准确度的检测结果，助力生物医疗领域的健康发展。