**人卵巢癌细胞A2780培养手册**

一、细胞培养条件

细胞名称：人卵巢癌细胞A2780

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：1640培养基 + 10% FBS + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P/S

传代方法：首次建议1:2传代，传代情况每2天换液

备注：使用无菌离心管收集培养基，以用于对比培养。如果对比效果不佳，建议直接购买[EVO视讯]的完全培养基。

二、细胞收到后处理

在细胞培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶，消毒后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行处理。借助显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行多倍数拍照保存（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片将作为售后依据，不提供照片的情况下默认收到状态良好。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞未达到80%汇合度时，将完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清液，使用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟；观察细胞消化情况，若细胞大部分脱落，迅速加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，用1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新鲜的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放回37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，待细胞皱缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，并转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清液后，沉淀细胞并加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中。如果后期需要将细胞转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放至少24小时后再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（请佩戴防护装备），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清液，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

某些细胞特性较为特殊，如贴壁不牢固，在运输过程中可能会发生细胞脱落，这是正常现象。请将培养瓶中的所有培养液收集至离心管，进行1000rpm离心5分钟，并收集上清作过渡培养。沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻操作后重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再次离心、弃去上清后，重悬后按1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞问题的重发情形及标准

1. 如细胞在运输过程中遭遇损坏，如丢失、瓶身破损或培养液严重漏出，均可重发。
2. 如在收到产品48小时内，若出现污染问题，需提供真实实验结果，核实后可重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，干冰发货的细胞复苏24小时后，如绝大多数细胞未存活（需提供状态照片），可重发。
4. 干冰发货的细胞在复苏24小时后或常温发货的细胞静置4小时后未经开封便出现污染，均可重发。
5. 如收到产品7天内提出细胞活性问题，并用台盼蓝染色法鉴定活力，核实后可重发。
6. 请在收到细胞当天以及第2、第3天拍照检查，3天内未告知视为产品合格；如在4-7天内出现问题，需提供收到细胞前3天的照片，详细操作步骤，并与技术人员沟通，判定责任后可重发。

2）不予重发的情形

1. 客户造成的细胞污染，不予重发；
2. 客户因操作不当造成细胞状态不佳，不予重发；
3. 非推荐细胞培养体系导致细胞状态不佳，不予重发；
4. 不提供细胞培养前3天照片，状态不佳的，不予重发；
5. 细胞培养时经其他处理的，不予重发；
6. 收到细胞2天内未告知的，不予重发；
7. 情况视具体情况而定。

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